Новый метод phage Tn-seq картирует необходимые гены и добавляет генетический материал

Новый метод призван упростить изучение и модификацию фагов за счёт выявления участков их геномов, необходимых для функционирования, и доставки в них дополнительного генетического материала. Метод, получивший название phage Tn-seq, испытали на фагах различных типов; с его помощью также удалось получить фаги с двумя искусственно созданными мутациями.

Результаты работы опубликованы в журнале Nature Microbiology, который издаётся через nature.com. По словам разработчиков, этот подход может помочь решить две давние проблемы исследований фагов: ограниченность знаний о том, как функционируют фаги, и сложность их быстрой перестройки для потенциального терапевтического применения.

Фаги играют важную роль в эволюции бактерий, и сейчас изучается возможность использовать их в качестве антимикробных средств. Прогресс зависит от понимания того, какие гены фага необходимы, как эти гены используются во время инфекции и как вводить новый генетический материал, не нарушая функционирование фага. Новый метод призван решить все эти задачи с помощью единой полногеномной стратегии.

Универсальный способ тестирования генов фагов

Phage Tn-seq объединяет мутагенез с использованием транспозона Tn5, отбор на основе активности анти-CRISPR и глубокое секвенирование. В общих чертах мутагенез транспозонами предполагает внесение вставок в разные участки генома. Затем исследователи могут определить, какие вставки сохранились после отбора, и установить места их расположения с помощью секвенирования.

Применительно к фагам это позволяет исследовать множество участков генома, а не изучать гены по одному. Метод сработал на фагах разных типов, включая гигантский фаг, образующий ядро. В рамках этого исследования данный результат имеет большое значение, поскольку показывает, что подход не ограничен одним типом фага или одной организацией генома.

Определения необходимых генов, полученные в результате, согласовывались с данными из двух других источников: структурной протеомики и сохранности основных генов. Структурная протеомика предоставила информацию о компонентах фага, а сравнение консервативных основных генов дало независимое представление о том, какие гены сохраняются у разных фагов. Согласованность этих подходов подтвердила полезность измерений, основанных на вставках.

Характер распределения вставок транспозонов также содержал информацию, выходящую за рамки определения необходимых генов. Смещения в местах возникновения вставок позволили авторам предсказать направление транскрипции. Те же закономерности помогли выявить участки, которые вводятся в клетку на ранних этапах, и участки с высокой экспрессией.

Создание фагов за несколько дней

Исследователи также использовали транспозоны как средства доставки нового генетического материала. Согласно исследованию, это позволило добавлять генетический материал в фаги в течение нескольких дней, что даёт более быстрый способ конструирования фагов по сравнению с методами, зависящими от менее полного понимания генома каждого фага.

В работе использовалась разработанная с помощью искусственного интеллекта система транспозонов Acr. Эту систему описали как ортогональную и применили для получения двойных мутантов фагов — то есть фагов, несущих две искусственно созданные мутации. Её включение расширяет возможности метода за пределы картирования уже существующих генов: тот же общий набор инструментов может помочь создавать фаги с намеренно объединёнными генетическими изменениями.

Кроме того, исследователи показали, что вставка транспозона возможна в фаги с гипермодифицированной ДНК. Такие химические модификации могут затруднять манипуляции с геномами фагов или их анализ. Демонстрация возможности вставки в такие фаги расширяет круг систем, к которым может применяться этот метод.

Значение инструмента

В исследовании phage Tn-seq представлен как универсальная платформа, а не как метод для решения одной узкой задачи. Его можно использовать для определения необходимых генов, получения сведений о транскрипции и ранней доставке генома, добавления генетического материала и создания двойных мутантов. Способность метода работать на разных фагах имеет ключевое значение для этого утверждения.

Сам по себе метод не даёт ответа на все вопросы о биологии фагов, однако позволяет быстрее получать полногеномные данные. Это может улучшить понимание того, как фаги эволюционируют и функционируют, и одновременно поддержать усилия по разработке фагов в качестве антимикробных средств.

Более широкая цель авторов — сделать фаги более доступными для систематических экспериментов. Объединяя мутагенез, отбор на основе анти-CRISPR и глубокое секвенирование, этот подход связывает изучение и конструирование в едином рабочем процессе. Таким образом, исследование представляет phage Tn-seq как основу как для изучения геномов фагов, так и для их применения в будущих методах лечения на основе фагов.