Novo método de Tn-seq de fagos mapeia genes essenciais e adiciona material genético

Um novo método busca facilitar o estudo e a modificação de fagos, identificando quais partes de seus genomas são essenciais e introduzindo neles material genético adicional. A técnica, chamada Tn-seq de fagos, foi testada em uma variedade de fagos e também produziu fagos portadores de duas mutações projetadas.

O trabalho é relatado na Nature Microbiology, publicada por meio de nature.com. Seus desenvolvedores afirmam que a abordagem pode ajudar a enfrentar dois obstáculos antigos na pesquisa sobre fagos: o conhecimento limitado sobre como eles funcionam e a dificuldade de reprojetá-los rapidamente para um possível uso terapêutico.

Os fagos são forças importantes na evolução das bactérias e estão sendo investigados por seu possível uso como antimicrobianos. O avanço depende de compreender quais genes dos fagos são necessários, como esses genes são usados durante a infecção e como uma nova carga genética pode ser introduzida sem desativar o fago. O novo método pretende responder a cada uma dessas perguntas por meio de uma única estratégia de escala genômica.

Uma forma ampla de testar genes de fagos

O Tn-seq de fagos combina mutagênese com o transposon Tn5, seleção baseada na atividade anti-CRISPR e sequenciamento profundo. Em termos gerais, a mutagênese com transposons introduz inserções em diferentes pontos de um genoma. Os pesquisadores podem então examinar quais inserções permanecem após a seleção e determinar onde elas ocorreram por meio do sequenciamento.

Aplicado aos fagos, isso permite analisar muitos locais genômicos, em vez de examinar os genes um por um. O método funcionou em fagos diversos, incluindo um fago jumbo que forma um núcleo. Esse resultado é significativo no âmbito do estudo porque mostra que a abordagem não está limitada a um único tipo de fago ou organização genômica.

As atribuições de essencialidade dos genes resultantes concordaram com evidências de duas outras fontes: proteômica estrutural e conservação de genes centrais. A proteômica estrutural forneceu informações sobre os componentes dos fagos, enquanto a comparação de genes centrais conservados ofereceu uma indicação independente de quais genes são mantidos entre os fagos. A concordância entre essas abordagens apoiou a utilidade das medições baseadas em inserções.

O padrão das inserções de transposons também continha informações que iam além da essencialidade dos genes. Vieses nos locais em que as inserções ocorreram permitiram aos autores prever a direção em que a transcrição prossegue. Os mesmos padrões ajudaram a identificar regiões que são injetadas no início e regiões que são expressas em níveis elevados.

Engenharia de fagos em poucos dias

Os pesquisadores também usaram transposons como veículos de entrega para novas cargas genéticas. Segundo o estudo, isso permitiu adicionar cargas aos fagos em poucos dias, oferecendo uma rota mais rápida para a engenharia de fagos do que os métodos que dependem de uma compreensão menos completa do genoma de cada fago.

O trabalho incluiu um sistema de transposão Acr projetado por inteligência artificial. Esse sistema foi descrito como ortogonal e usado para gerar mutantes duplos de fagos, ou seja, fagos portadores de duas mutações projetadas. Sua inclusão amplia o método para além do mapeamento de genes existentes: o mesmo conjunto geral de ferramentas pode ajudar a construir fagos com alterações genéticas combinadas deliberadamente.

Os pesquisadores demonstraram ainda que era possível inserir transposons em fagos cujo DNA é hipermodificado. Essas modificações químicas podem tornar os genomas dos fagos mais difíceis de manipular ou analisar. A demonstração de inserção nesses fagos amplia o conjunto de sistemas aos quais a técnica pode ser aplicada.

Por que a ferramenta é importante

O estudo apresenta o Tn-seq de fagos como uma plataforma versátil, e não como um método projetado para uma única tarefa específica. Ele pode ser usado para atribuir genes essenciais, extrair pistas sobre a transcrição e a entrega inicial do genoma, adicionar cargas genéticas e criar mutantes duplos. Seu desempenho em diferentes fagos é central para essa afirmação.

O método não resolve por si só todas as questões sobre a biologia dos fagos, mas oferece uma forma de gerar evidências de escala genômica com mais rapidez. Isso pode melhorar a compreensão de como os fagos evoluem e funcionam, ao mesmo tempo que apoia os esforços para desenvolvê-los como antimicrobianos.

O objetivo mais amplo dos autores é tornar os fagos mais acessíveis à experimentação sistemática. Ao combinar mutagênese, seleção baseada em anti-CRISPR e sequenciamento profundo, a abordagem conecta descoberta e engenharia em um único fluxo de trabalho. O estudo, portanto, posiciona o Tn-seq de fagos como uma base tanto para investigar genomas de fagos quanto para aplicá-los em futuras terapias baseadas em fagos.