Un nuovo metodo di phage Tn-seq mappa i geni essenziali e aggiunge materiale genetico

Un nuovo metodo mira a rendere più facile lo studio e la modifica dei fagi, identificando quali parti dei loro genomi sono essenziali e introducendo al loro interno materiale genetico aggiuntivo. La tecnica, chiamata phage Tn-seq, è stata testata su un’ampia gamma di fagi e ha inoltre prodotto fagi portatori di due mutazioni ingegnerizzate.

Il lavoro è descritto in Nature Microbiology, pubblicata attraverso nature.com. Secondo i suoi sviluppatori, l’approccio potrebbe contribuire a superare due ostacoli di lunga data nella ricerca sui fagi: la conoscenza limitata del funzionamento dei fagi e la difficoltà di riprogettarli rapidamente per un possibile uso terapeutico.

I fagi sono importanti forze nell’evoluzione dei batteri e vengono studiati per il loro possibile impiego come antimicrobici. I progressi dipendono dalla comprensione di quali geni dei fagi siano necessari, di come tali geni vengano utilizzati durante l’infezione e di come sia possibile introdurre nuovo materiale genetico senza disabilitare il fago. Il nuovo metodo intende affrontare ciascuna di queste questioni attraverso un’unica strategia su scala genomica.

Un metodo ampio per testare i geni dei fagi

Il phage Tn-seq combina la mutagenesi con il trasposone Tn5, la selezione basata sull’attività anti-CRISPR e il sequenziamento ad alta profondità. In termini generali, la mutagenesi con trasposoni introduce inserzioni in diversi punti di un genoma. I ricercatori possono quindi esaminare quali inserzioni rimangono dopo la selezione e determinare dove si sono verificate attraverso il sequenziamento.

Applicato ai fagi, questo rende possibile esaminare numerose regioni genomiche invece di analizzare i geni uno alla volta. Il metodo ha funzionato su fagi diversi, tra cui un fago gigante che forma un nucleo. Questo risultato è significativo nell’ambito dello studio perché dimostra che l’approccio non è limitato a un singolo tipo di fago o a una sola organizzazione genomica.

Le assegnazioni relative all’essenzialità dei geni ottenute hanno concordato con le evidenze provenienti da altre due fonti: la proteomica strutturale e la conservazione dei geni fondamentali. La proteomica strutturale ha fornito informazioni sui componenti dei fagi, mentre il confronto dei geni fondamentali conservati ha offerto un’indicazione indipendente di quali geni siano mantenuti tra i fagi. La concordanza tra questi approcci ha sostenuto l’utilità delle misurazioni basate sulle inserzioni.

Il modello delle inserzioni dei trasposoni conteneva inoltre informazioni che andavano oltre l’essenzialità dei geni. Le differenze nella distribuzione delle inserzioni hanno permesso agli autori di prevedere la direzione in cui procede la trascrizione. Gli stessi modelli hanno contribuito a identificare le regioni che vengono iniettate precocemente e quelle espresse a livelli elevati.

Ingegnerizzare i fagi in pochi giorni

I ricercatori hanno inoltre utilizzato i trasposoni come veicoli per introdurre nuovo materiale genetico. Secondo lo studio, ciò ha permesso di aggiungere il materiale genetico ai fagi nel giro di pochi giorni, offrendo una via più rapida all’ingegnerizzazione dei fagi rispetto ai metodi che dipendono da una comprensione meno completa del genoma di ciascun fago.

Il lavoro comprendeva un sistema di trasposoni Acr progettato mediante intelligenza artificiale. Questo sistema è stato descritto come ortogonale ed è stato utilizzato per generare doppi mutanti fagici, cioè fagi portatori di due mutazioni ingegnerizzate. La sua inclusione estende il metodo oltre la mappatura dei geni esistenti: lo stesso kit di strumenti generale può contribuire a costruire fagi con modifiche genetiche combinate deliberatamente.

I ricercatori hanno inoltre dimostrato che l’inserzione di trasposoni era possibile nei fagi il cui DNA è ipermodificato. Queste modifiche chimiche possono rendere i genomi dei fagi più difficili da manipolare o analizzare. La dimostrazione dell’inserzione in questi fagi amplia la gamma di sistemi a cui la tecnica può essere applicata.

Perché lo strumento è importante

Lo studio presenta il phage Tn-seq come una piattaforma versatile, anziché come un metodo progettato per un unico compito specifico. Può essere utilizzato per assegnare i geni essenziali, ricavare indicazioni sulla trascrizione e sulla consegna precoce del genoma, aggiungere materiale genetico e creare doppi mutanti. Le sue prestazioni su fagi diversi sono fondamentali per questa tesi.

Il metodo non risolve da solo ogni questione sulla biologia dei fagi, ma offre un modo per generare più rapidamente evidenze su scala genomica. Ciò potrebbe migliorare la comprensione di come i fagi evolvono e operano, sostenendo al contempo gli sforzi per svilupparli come antimicrobici.

L’obiettivo più ampio degli autori è rendere i fagi più accessibili alla sperimentazione sistematica. Combinando mutagenesi, selezione basata sull’anti-CRISPR e sequenziamento ad alta profondità, l’approccio collega scoperta e ingegnerizzazione in un unico flusso di lavoro. Lo studio presenta quindi il phage Tn-seq come una base sia per lo studio dei genomi dei fagi sia per il loro impiego in future terapie basate sui fagi.